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【干貨分享】第二期:顏色補償那些事兒

多重熒光PCR已經(jīng)廣泛地使用在各種病原體的檢測中,這得益于熒光PCR檢測儀多通道熒光采集的功能。

2022-01-20

多重熒光PCR已經(jīng)廣泛地使用在各種病原體的檢測中,這得益于熒光PCR檢測儀多通道熒光采集的功能。在使用羅氏480(LC1/LC2/Z cobas)進(jìn)行多重檢測時(shí),往往會(huì )遇到需要做顏色補償的情況,那么今天小編就與您聊一聊關(guān)于顏色補償的那些事兒~

為什么羅氏480需要做顏色補償?

首先,我們來(lái)看一下羅氏480的激發(fā)波長(cháng)及檢測波長(cháng)
LightCycler1的濾光片:

圖片.png

LightCycler2的濾光片:

圖片.png

熒光通道發(fā)射光譜拋物線(xiàn)示意圖:

圖片.png

從上圖可以看出在一個(gè)多色反應中,由于各染料的發(fā)射光的波長(cháng)有重疊,導致一個(gè)通道能夠捕獲到另一個(gè)通道所檢測的染料信號。這種熒光信號的溢出會(huì )導致無(wú)效的數據產(chǎn)生,即我們常說(shuō)的“串色”或“串孔”現象。

由于每臺儀器的濾光片是固定的,無(wú)法改變其激發(fā)光與檢測光波長(cháng);想要校正這種溢出,在運行這個(gè)實(shí)驗或分析這個(gè)數據時(shí),就需要應用顏色補償目標。當用顏色補償目標時(shí),LightCycler 算法會(huì )使用補償實(shí)驗文件中的數據來(lái)補償熒光值的溢出,補償后即可以看到每個(gè)通道特定的信號。


什么時(shí)候要做顏色補償?
只有當多個(gè)熒光通道(比如VIC和ROX同時(shí)使用)用于數據分析時(shí)才有必要采用顏色補償,當使用單通道時(shí)無(wú)需采用顏色補償。
另外,由于合成的探針的熒光染料各個(gè)廠(chǎng)家之間存在一定的差異性,因此,不同廠(chǎng)家之間的顏色補償數據一般不通用。在更換檢測試劑盒時(shí),需要進(jìn)行對應廠(chǎng)家試劑的顏色補償實(shí)驗哦~

如何使用顏色補償?

首先,按顏色補償說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顏色補償實(shí)驗
其次,進(jìn)行常規的檢測實(shí)驗
最后,在每次檢測完畢的分析界面調用補償數據,具體操作如下:
A. 點(diǎn)擊Color Comp 旁下拉菜單

圖片.png

B. 選擇In Database

圖片.png

C. 選擇補償實(shí)驗數據

圖片.png

D. 最后重新計算即可
E. 補償前后結果對比:

圖片.png

補償前

 圖片.png

補償后

從補償前后結果來(lái)看,即可確定VIC通道中的翹尾,是ROX通道串孔所致。羅氏480分析界面調用補償文件的方法也是一鍵操作,十分簡(jiǎn)便。針對一個(gè)廠(chǎng)家的試劑,顏色補償實(shí)驗只需做一次,數據便可一直使用。

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