集高靈敏度、快速、高特異性于一身的qPCR，是分子診斷學(xué)最常用的一種方法；然而，大家常常會(huì )被它的異常曲線(xiàn)所困擾。比如，某個(gè)通道所有陰性樣本的擴增曲線(xiàn)都向下傾（如下圖）。今天，伯杰技術(shù)就與您分享導致這種“怪異曲線(xiàn)”的原因及解決方案。

原因分析

這種怪異曲線(xiàn)下傾的根本原因是qPCR儀矯正過(guò)度導致的，熒光的發(fā)射光譜是一個(gè)拋物線(xiàn)，常見(jiàn)的熒光物質(zhì)FAM、 VIC、 ROX的發(fā)射光譜之間存在交叉（如下圖），qPCR 儀通過(guò)計算減去因交叉誤讀的信號，常見(jiàn)的計算方法是：A 通道計算得到的信號（FA）= A通道檢測的信號– B通道檢測的信號*K，這個(gè)的K是機器預設的固定參數；有時(shí)，B通道串到A通道的實(shí)際信號的比值要小于固定參數K，設備在計算時(shí)就導致了A 通道擴增曲線(xiàn)向下傾斜的情況。

舉個(gè)例子，在FAM通道檢測的信號中，假設機器預設ROX通道串到FAM 通道的K=20%，但是實(shí)際上串到FAM 通道的ROX信號只占ROX通道檢測信號的10%；而機器在計算時(shí)，只會(huì )按照預設的固定參數K=20%進(jìn)行計算，即，FAM通道每次都會(huì )多減去10% ROX通道的檢測信號。隨著(zhù)擴增ROX通道信號越來(lái)越大，FAM通道多減去的信號也越來(lái)越大，若此時(shí)FAM 通道是陰性樣本，就導致擴增曲線(xiàn)傾斜的更嚴重。

解決方法

2、點(diǎn)擊”P(pán)late” → “Advanced Setup”，關(guān)閉其他通道，如下圖所示：

3、點(diǎn)擊”Results”，回到結果分析界面，然后，點(diǎn)擊“Analyze”重新分析即可，如下圖所示：

看，重新分析后的曲線(xiàn)，是不是清爽許多？回到了原來(lái)那熟悉的樣子

（本文以ABI Q5儀器為例，其他機型如遇該問(wèn)題，也可使用該方法調整、分析）