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【干貨分享】第五期：數字PCR知多少
在PCR擴增階段，數字PCR先將樣品稀釋到單分子水平，再平均分配到幾十至幾萬(wàn)個(gè)單元中進(jìn)行反應。
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在定量PCR時(shí)，我們常常糾結一個(gè)問(wèn)題，究竟是相對定量還是絕對定量呢？如今，你無(wú)需糾結了，因為數字PCR（digital PCR）來(lái)了。盡管這兩種技術(shù)有些類(lèi)似，都是估算起始樣品中的核酸量，但它們有一個(gè)重要的區別：定量PCR是依靠標準曲線(xiàn)或參照基因來(lái)測定核酸量，而數字PCR則讓你能夠直接數出原始拷貝數，是對起始樣品的絕對定量。
在PCR擴增階段，數字PCR先將樣品稀釋到單分子水平，再平均分配到幾十至幾萬(wàn)個(gè)單元中進(jìn)行反應。與qPCR對每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測定的方法不同，數字PCR是在擴增結束后對每個(gè)反應單元的熒光信號進(jìn)行采集，有熒光信號記為1，無(wú)熒光信號記為0，有熒光信號的反應單元中至少包含一個(gè)拷貝。
數字PCR原理示意圖
由于dPCR是一種終端分析法，如果目標分子沒(méi)有很好的離散化，如一些小室在結束時(shí)具有不止一個(gè)的靶標，那么理論上結果得到的濃度可能就會(huì )棄之不用，這就是泊松統計發(fā)揮作用的地方。采用泊松概率分布公式(Poisson distribution)進(jìn)行計算，根據數字PCR反應單元總數和有熒光信號的單元數以及樣品的稀釋倍系數,就可以得到樣本的最初拷貝數(濃度)。
1999年，Vogelstein和Kinzler首次提出了數字PCR概念。2006年，Fluidigm公司推出了第一臺基于芯片的商品化數字PCR系統，而后QuantaLife又利用油包水微滴生成技術(shù)開(kāi)發(fā)了微滴式數字PCR技術(shù)。在QuantaLife公司被Bio-Rad公司收購后，其微滴式數字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號儀。2013年，該公司又推出了升級型號QX200。
利用微滴發(fā)生器可以一次生成數萬(wàn)乃至數百萬(wàn)個(gè)納升甚至皮升級別的單個(gè)油包水微滴，該微滴是數字PCR的樣品分散載體；PCR反應結束后再利用檢測儀器檢測每個(gè)微滴的熒光信號。大量的微滴提供了足夠的精確度，能準確測定拷貝數狀態(tài)。微滴式數字PCR（ddPCR）的出現使得數字PCR的靈敏度上升到了新的臺階。
目前，數字PCR在液體活檢中具有廣泛的應用，包括基因表達差異化研究、基因組學(xué)及表觀(guān)遺傳學(xué)研究等。其在低濃度和低豐度病原體中的絕對定量、無(wú)標準品病原體絕對定量中的應用也逐漸凸顯，特別是隨著(zhù)新冠疫情的發(fā)展，對于低拷貝數樣本的檢測逐漸成為了研究熱點(diǎn)與關(guān)注焦點(diǎn)。
伯杰醫療始終堅持創(chuàng )新，致力于成為真正的“病原體診斷專(zhuān)家”。目前，伯杰技術(shù)服務(wù)部已推出新型冠狀病毒、流感病毒、諾如病毒等病原體數字PCR檢測服務(wù)。
該項服務(wù)基于伯杰醫療近期引進(jìn)的法國stilla數字PCR儀，儀器采用最新的油包水微滴生成技術(shù)，靈敏度可達0.2拷貝/uL；同時(shí)，該數字PCR平臺將結合伯杰先進(jìn)的測序技術(shù)，更深入地在呼吸道病原體檢測領(lǐng)域譜寫(xiě)新篇章！
上海伯杰醫療科技有限公司是一家致力于感染性病原體分子診斷試劑研發(fā)和應用，深耕于多重熒光 PCR 診斷試劑和痕量病毒二代測序試劑及相關(guān)服務(wù)的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司圍繞感染性病原體這一主線(xiàn)，從診斷試劑、診斷儀器、測序服務(wù)和醫檢所服務(wù)等多個(gè)面提供全套解決方案。公司秉承“勇于創(chuàng )新，質(zhì)量為先”的方針，為醫療機構、疾控公衛、高?？蒲械群献骰锇樘峁﹥?yōu)質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)。
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