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【干貨分享】第四期:PCR結果分析,自動(dòng)基線(xiàn)也別用啦

基線(xiàn)是指在PCR擴增反應的最初數個(gè)循環(huán)里,熒光信號變化不大,接近一條直線(xiàn),即所謂的基線(xiàn)(如圖1)。

2022-02-21


上期干貨分享,淘氣的小編留了一手,其實(shí)調節閾值線(xiàn)在A(yíng)BI7500上還有更快捷的方法,只要在曲線(xiàn)圖下方把“Auto”取消,再點(diǎn)擊勾選Show:Threshold就可以啦?。ㄈ缦聢D所示)

細心的你可能發(fā)現,除了Threshold(閾值線(xiàn)),還有Auto Baseline(自動(dòng)基線(xiàn))。在通常情況下,PCR實(shí)驗結束,閾值線(xiàn)和基線(xiàn)都是默認為“Auto”的,今天,我們就來(lái)聊一聊什么是基線(xiàn)?取消自動(dòng)基線(xiàn),如何調節基線(xiàn)范圍?以及,基線(xiàn)調節和閾值線(xiàn)調節是怎樣配合分析PCR結果的?
 1. 什么是基線(xiàn)? 

基線(xiàn)是指在PCR擴增反應的最初數個(gè)循環(huán)里,熒光信號變化不大,接近一條直線(xiàn),即所謂的基線(xiàn)(如圖1)。
基線(xiàn)范圍的設置是同步設置的,即不管一個(gè)實(shí)驗數據里面有多少擴增曲線(xiàn)和通道,以及各曲線(xiàn)指數增長(cháng)期的起始位置,以ABI7500為例,該儀器一般默認的起始和終止循環(huán)數為3~15個(gè)循環(huán)(如圖2)。
圖 1

圖 2



2. 儀器自動(dòng)基線(xiàn)與手動(dòng)基線(xiàn)會(huì )呈現怎樣不同的結果?

情況一:你是否也遇到過(guò)這樣擴增曲線(xiàn),如圖3所示,器自動(dòng)基線(xiàn)設置的太寬,就會(huì )導致基線(xiàn)下傾的現象。

圖 3

導致這種現象的主要原因就是機器自動(dòng)基線(xiàn)設置的太寬導致的,標本在15個(gè)循環(huán)之前就進(jìn)入指數增長(cháng)期,而機器自動(dòng)基線(xiàn)固定的把指數增長(cháng)期作為基線(xiàn),就導致此種曲線(xiàn)的出現,只需手動(dòng)把基線(xiàn)起始循環(huán)數調整為指數增長(cháng)期之前即可,比如將此數據的起止循環(huán)數調整為3-8個(gè)循環(huán)數后,擴增曲線(xiàn)就恢復正常了,如圖4所示:

圖 4


情況二:基線(xiàn)不平,不僅可能存在的弱陽(yáng)性曲線(xiàn)“被淹沒(méi)”,還導致閾值線(xiàn)“無(wú)從安放”,如圖5所示:

圖 5

此時(shí),只需手動(dòng)把基線(xiàn)的起止循環(huán)數調整到合適位置即可,比如,把圖5的起止循環(huán)數改為10-20個(gè)循環(huán)后,基線(xiàn)就會(huì )變平整,閾值線(xiàn)也不再“無(wú)從安放”,如圖6所示:

圖 6


情況三:實(shí)驗中常見(jiàn)的氣泡干擾實(shí)驗結果分析,如圖7所示:

圖 7

氣泡導致的折線(xiàn),不僅影響閾值線(xiàn)調節的準確性,更會(huì )影響結果的判讀。這種情況怎么調整基線(xiàn)呢?很簡(jiǎn)單,只需把基線(xiàn)的起始循環(huán)數設置在氣泡出現的循環(huán)數后即可。比如,圖7中的2個(gè)孔位氣泡破裂的循環(huán)數為11、14,我們將起止循環(huán)數設置為15-20后,即可恢復正常,如圖8所示:

圖 8

此時(shí)調節閾值線(xiàn),會(huì )更容易判斷閾值線(xiàn)應該處于什么位置(可以參考上一篇干貨——調節閾值線(xiàn)),從而得到更準確的Ct值。



3. 如何手動(dòng)調節基線(xiàn)?

文章開(kāi)頭介紹了在A(yíng)BI7500上調節手動(dòng)基線(xiàn)的快捷方法;而根據儀器的區別,調節基線(xiàn)的方式也會(huì )有所區別。一般來(lái)說(shuō),調節基線(xiàn)的位置都會(huì )在“Analysis”→ “Analysis Settings”這樣的菜單欄選項中,取消所有的“Auto…”,輸入合適的基線(xiàn)范圍,再“Apply”即可。不知道多少合適?沒(méi)關(guān)系,多調試幾個(gè)基線(xiàn)的范圍就可以調整出既美觀(guān)又準確的基線(xiàn)了。


關(guān)于伯杰醫療

上海伯杰醫療科技有限公司是一家致力于感染性病原體分子診斷試劑研發(fā)和應用,深耕于多重熒光 PCR 診斷試劑和痕量病毒二代測序試劑及相關(guān)服務(wù)的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司圍繞感染性病原體這一主線(xiàn),從診斷試劑、診斷儀器、測序服務(wù)和醫檢所服務(wù)等多個(gè)面提供全套解決方案。公司秉承“勇于創(chuàng )新,質(zhì)量為先”的方針,為醫療機構、疾控公衛、高??蒲械群献骰锇樘峁﹥?yōu)質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)。

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